206
2023-04-22 18:58目的 了解重庆市主城区嘉陵江和长江水中有机物污染状况，评价水中有机污染物对人群健康的影响。方法 固相萃取法萃取水中有机污染物，将萃取的有机污染物溶于二甲基亚砜(DMSO)中，对H4IIE细胞进行染毒，用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)检测水中有机污染物对H4IIE细胞增殖的抑制作用，并用荧光比色法检测水中有机污染物对H4IIE细胞7-乙氧基-3-异吩嗯唑酮・脱乙基酶(EROD)的诱导作用。结果 各水样处理H4IIE细胞后，H4IIE细胞的增殖随染毒时间和剂量的增加而呈下降趋势。48和72h处理组200和250倍浓缩的水样对细胞增殖有显著抑制作用(P<0�05，与溶剂对照组比较)；2，3，7，8-四氯二苯并-对-二恶英(TCDD)对EROD诱导的半数有效剂量(EC50)值为4�4pg／ml，各水样相对于2，3，7，8-TCDD的毒性当量值分别为(2004�08)大溪沟：2�2×10-4pg／L；(2004�08)寸滩：0�9×10-4pg／L；(2005�01)大溪沟：13�3×10-4pg／L；(2005�01)寸滩：3�7×10-4pg／L。结论 污染物对H4IIE细胞的毒性呈现出时间和剂量依赖性；各水样均可诱导H4IIE细胞EROD活性；同一采样点中，枯水期水样毒性大于丰水期水样。
【关键词】 有机污染物
重庆市是三峡库区最大的城市，嘉陵江和长江是重庆市的主要水源，研究水中有机污染物对哺乳动物体外培养细胞的毒性，对于评价三峡库区水源水对人群健康的影响十分必要。H4IIE细胞是研究有机污染物毒性常用的细胞株。本文从有衡模穗机污染物对H4IIE细胞增殖的抑制和对7-乙氧基-3-异吩嗯唑酮・脱乙基酶(Ethoxy-Resorufin-O-Deethylase，EROD)的诱导两方面码梁对2004～2005年重庆市主城区长江和嘉陵江段水中有机污染物的毒性进行了分析。
1 材料与方法
1�1 试剂和仪器 XAD-2树脂、四甲基偶氮噻咐卜唑蓝(MTT)、7-乙氧基-3-异吩嗯唑酮(Ethoxy-Resorufin，ERF)、香豆素(美国Sigma公司)；2，3，7，8四氯二苯并-对-二恶英(tetrochlorodibenzo-p-dioxins，TCDD)标准品(美国Cambrige公司)；DMEM培养基、小牛血清(美国Hyclone公司)；自制不锈钢柱；旋转蒸发仪(上海申科机械研究所)；多用途酶标仪(美国Biotech公司)。
1�2 水中有机污染物的萃取 选择重庆市主城区大溪沟作为嘉陵江的取水点，寸滩作为长江取水点，分别于2004年8月(丰水期)和2005年1月(枯水期)进行水样采集。在不锈钢柱中按树脂：江水=1∶2000(V∶V)的比例装填已活化的XAD-2树脂，将江水用玻璃纤维棉过滤除去水中悬浮物后通过不锈钢柱，控制流速为0�5～1倍柱体积／min。过柱完毕，用真空泵将柱中水份吸干，用丙酮：正己烷(1∶1)洗脱XAD-2树脂中吸附的有机污染物，旋转蒸发，氮气吹干后按1ml 二甲基亚砜(DMSO)中溶解50 L江水中有机污染物的比例将萃取的有机污染物溶于DMSO，-20℃保存。
1�3 MTT实验 H4IIE细胞按1×104／孔接种于96孔平底培养板中，放入37℃、5％CO2培养箱中培养，培养基为含10％小牛血清的DMEM。加入溶于DMSO的有机污染物进行染毒，设立空白对照组、DMSO溶剂对照组、25，50，100，150，200，250倍污染物组，每个浓度每个时相点至少设6个平行孔。于暴露后的24，48，72h分别取培养板，将原培养液去除，换含20μl MTT(5mg／ml)的新鲜培养基200μl，再培养4h，去上清，加DMSO 200μl／孔，振摇5min，于酶标仪上490nm下，空白调零，测Dλ值，用Excel软件绘制细胞增殖曲线。
图1 不同浓度的2，3，7，8-TCDD标样对H4IIE细胞EROD酶诱导的剂量-效应曲线（略）
1�4 EROD实验 H4IIE细胞按1×104／孔接种于96孔平底培养板中，放入37℃、5％CO2培养箱中培养，培养基为含10％小牛血清的DMEM。当细胞达到70％融合时加入溶于DMSO的0�75～40pg／25μl 的2，3，7，8-TCDD标准品，以及溶于DMSO的有机污染物进行染毒，染毒剂量分别为2�5，25，250倍污染物，加入DMSO的体积占终体积的0�5％，每个浓度每个时相点至少设6个平行孔。暴露72h后，去除原培养基，加入100μl 新鲜的含8μmol／L的ERF和10μmol／L的香豆素的培养基，继续培养60min。然后，将每孔中的培养基移入一新的96孔板的对应孔中，并加入130μl乙醇终止反应。于荧光酶标仪上535nm激发波长/590nm吸收波长条件下测反应终产物异吩嗯唑酮(Resorufin，RF)的荧光强度。用Origin6�0软件制定荧光强度与2，3，7，8-TCDD浓度间的剂量-效应曲线，并从标准曲线中求得每个水样相对于2，3，7，8-TCDD标准品的毒性当量(toxic equivalency，TEQ)值。
2 结果
2�1 水中有机污染物对H4IIE细胞增殖的影响 各水样处理H4IIE细胞后，H4IIE细胞的增殖随染毒时间和剂量的增加而呈下降趋势，其中72h 处理组剂量-效应关系最好。在48和72h 处理组200和250倍浓缩的2005年1月大溪沟水样和2005年1月寸滩水样对细胞增殖有抑制(P<0�05，与溶剂对照组比较)，其他各种处理与对照比较，差异无统计学意义。从48和72h 处理组细胞增殖曲线看，同一采样点枯水期水样对细胞增殖的抑制作用大于丰水期水样，而同一采样期大溪沟水样与寸滩水样对细胞增殖的抑制作用差异无统计学意义。
2�2 水中有机污染物对H4IIE细胞EROD的诱导(图1) 根据不同浓度的2，3，7，8-TCDD标样对H4IIE细胞EROD酶诱导绘出剂量-效应曲线。从标准曲线上可以求出，2，3，7，8-TCDD的EC50值为4�4pg／ml，即0�88pg／孔。250倍浓缩的(2004�08)大溪沟水样、(2004�08)寸滩水样、(2005�01)寸滩水样以及25倍浓缩(2004�08)大溪沟水样的EROD活性的诱导值落在此剂量-效应曲线的线性范围内，从标准曲线上求得各水样相对于2，3，7，8-TCDD标样的TEQ值分别为(2004�08)大溪沟：2�2×10-4pg／L；(2004�08)寸滩：0�9×10-4pg／L；(2005�01)大溪沟：13�3×10-4pg／L；(2005�01)寸滩：3�7×10-4pg／L。
3 讨论
重庆市主城区长江和嘉陵江水中有机污染物的类型以多环芳烃类和邻苯二甲酸酯类为主〔1〕，这些化合物在水中的含量都比较低，但考虑到这些化合物种类繁多，而且混合物之间存在叠加和增效效应，所以有必要对水中POPs混合物的毒性效应进行评价。MTT的检测结果表明，H4IIE细胞的增殖随有机提取物染毒时间和剂量的增加而呈下降趋势。有机污染物在水中的浓度虽然很低，但由于其具有难降解性和可随生物链积累的特点，使其在水生生物体内可达到104～107倍的富集〔2〕，如此高的富集浓度对水生动植物细胞及食用水生动植物的人类细胞的毒性不容忽视。水中多种有机物，包括所有的二恶英类化合物，多氯联苯类化合物，以及大部分的多环芳烃类化合物，它们在H4IIE细胞中有相同的信号途径-芳烃受体途径〔3〕。EROD法是国际上通用的检测芳烃受体途径活化程度的方法〔4〕，此方法利用与AHR结合能力最强的2，3，7，8-TCDD做为标准品，其他化合物的毒性以此为基准，可得出其毒性当量〔5〕。本文结果表明，长江和嘉陵江水中有机物的TEQ值均在10-4pg/L范围，枯水期水样毒性略大于丰水期，与文献〔6〕结果比较类似。芳烃受体途径的激活会导致动物产生神经毒性、免疫功能紊乱、生殖和发育障碍以及癌变等毒性效应〔7〕，所以应引起足够重视。长江和嘉陵江水中有机污染物中除了能激活H4IIE细胞的多环芳烃类化合物外，还含有较多的邻苯二甲酸酯类化合物，此类化合物几乎不激活动物细胞的芳烃受体途径〔8〕。邻苯二甲酸酯类化合物的毒性主要表现为雄性生殖毒性〔9〕，对水中有机污染物的雄性生殖毒性尚待进一步研究。